标题：在EGFR突变NSCLC预临床模型奥西替尼联合培美曲塞或顺铂产生持久的抗癌效果

　　背景

　　第三代表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)奥西替尼最初被批准用于T790M阳性非小细胞肺癌(NSCLC)，最近被批准用于EGFR突变的T790M阴性NSCLC患者的一线治疗。与上一代TKIs类似，尽管有很高的应答率，但疾病最终会发生进展，目前的临床研究主要集中在延缓奥西替尼耐药出现的新策略上。在本研究中，我们研究了奥西替尼与培美曲塞或顺铂联合应用于EGFR突变的NSCLC细胞系和异种移植模型。

　　方法

　　在PC9T790M异种移植模型中评估肿瘤生长，并进行组织形态测定。采用PC9、PC9T790M和HCC827细胞系体外检测奥西替尼联合化疗的疗效。用MTT法和荧光显微镜观察细胞活力和细胞死亡。采用免疫印迹法、荧光原位杂交法、新一代测序法和数字微滴PCR法分析蛋白表达和基因状态。

　　结果

　　在异种移植瘤模型中，奥西替尼显著抑制了肿瘤的生长，然而，正如预期的那样，50%的小鼠产生了耐药性。奥西替尼与培美曲塞或顺铂联合使用可预防或至少延迟耐药的发生。有趣的是，这样的组合增加了纤维化组织碎片的比例，并在停止治疗后产生了持久的活性。体外研究表明，在PC9T790M细胞以及T790M阴性PC9和HCC827细胞系中，联合治疗在抑制细胞增殖和诱导细胞死亡方面的作用强于单一治疗，提示该策略也可作为一线治疗。最后，我们证明，无论是来自耐药性肿瘤的克隆还是在体外产生的克隆，对培美曲塞的敏感性都较低，这促使奥西替尼治疗进展的患者使用不含培美曲塞的化疗方案。

　　结论

　　我们的结果证实了奥西替尼与培美曲塞或顺铂联合治疗EGFR突变的NSCLC具有潜在的应用价值，这可能会延缓奥西替尼耐药的出现，并产生持久的应答。

　　奥西替尼和培美曲塞联合作用PC9T790M异种移植模型。A,裸雌性老鼠皮下接种PC9T790M细胞，之后，肿瘤已达到平均规模约150 mm3，老鼠使用媒介治疗作为参照(ctrl) 奥西替尼组(3mg/kg 一次/天，每周5次)(osi), 奥西替尼每周插入培美曲塞组(100mg/kg 一天一次，每周两次)(osi→pem),或奥西替尼插入培美曲塞到奥西替尼维持组(osi+ pem→osi)。每周测量肿瘤体积（Y轴）两次，数据以体积±SEM表示(每组8个肿瘤)。与奥西替尼组相比，显著性分别为*p<0.05, **p<0.01,****p<0.0001;双向重复测量方差分析，然后Bonferroni的后检验。B,体重（Y轴）每周测量两次，数据以体重变化百分比±SEM表示(每组8个肿瘤)。与奥西替尼比较，显著性差异为*p<0.05;双向重复测量方差分析，然后Bonferroni的后检验。C,在110天停止治疗，每组4只动物继续观察28天肿瘤生长情况。D,数据以肿瘤体积变化（Y轴）百分比表示：t为第138天(药物停止后28天)的肿瘤体积，t0为第110天的肿瘤体积。显著性差异** p<0.01;两组均数比较采用student t检验。

　　奥西替尼联合顺铂作用PC9T790M异种移植模型。A, 裸雌性老鼠皮下接种PC9T790M细胞，之后，肿瘤已达到平均规模约150 mm3，老鼠使用媒介治疗作为参照(ctrl) 奥西替尼组(3mg/kg 一次/天，每周5次)(osi), 奥西替尼每周插入顺铂组(4mg/kg 一天一次，每周两次)(osi→cis),或奥西替尼插入培美曲塞到奥西替尼维持组(osi+cis→osi)。每周测量肿瘤体积（Y轴）两次，数据以体积±SEM表示(每组8个肿瘤)。与奥西替尼组相比，显著性差异分别为* p<0.05, ** p<0.01;双向重复测量方差分析，然后Bonferroni的后检验。B,体重每周测量两次，数据以体重变化百分比±SEM表示(每组8个肿瘤)。与奥西替尼相比，显著性差异分别为*p<0.05, **p<0.01,****p<0.0001;双向重复测量方差分析，然后Bonferroni的后检验。C,在第77天停止联合治疗，然后在4只动物中继续监测肿瘤生长35天。

　　奥西替尼联合培美曲塞或顺铂对PC9T790M细胞增殖和细胞死亡诱导的影响。A, PC9T790M细胞分别用50nM奥西替尼、50nM 培美曲塞或500nM顺铂治疗。osi→pem 和osi→cis组是奥西替尼开始治疗后第3天到第6天和第9到第12天进行培美曲塞或顺铂的插入治疗。osi+ pem→osi 和osi+cis→osi 组是奥西替尼开始治疗0-3天和6-9天进行培美曲塞或顺铂的插入治疗。12天后进行结晶紫测定，在570 nM处测定吸光度。结果代表了三个独立的实验。与奥西替尼相比，显著性差异分别为*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001;采用Bonferroni的事后检验进行单因素方差分析。B,PC9T790M细胞按规定的时间进行48小时的药物治疗。治疗结束时，用荧光显微镜对Hoechst 33342和碘化丙啶染色细胞进行定量分析。结果为三个独立实验的平均值±标准差(SD)。与奥西替尼相比，显著性差异分别为*p<0.05，**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.001;采用Bonferroni的事后检验进行单变量方差分析。

　　奥西替尼联合培美曲塞或顺铂对EGFR突变PC9和HCC827细胞增殖和细胞死亡诱导的影响。A,PC9和HCC827细胞分别用50nM奥西替尼、50nM培美曲塞或500nM顺铂按照图3a所示的时间表进行治疗。12天后进行结晶紫测定，在570 nm处测定吸光度。结果代表了三个独立的实验。Y轴表示细胞增殖比例，与奥西替尼相比，显著性差异分别为*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001;采用Bonferroni的事后检验进行单因素方差分析。B,PC9和HCC827细胞根据图3b所示的时间表，分别用50nM奥西替尼、5nM培美曲塞或500nM顺铂治疗。治疗结束时，用荧光显微镜对Hoechst 33342和碘化丙啶染色细胞进行定量分析。结果为三个独立实验的平均值(±标准差SD)。Y轴表示细胞死亡百分数，与参照组相比，显著性差异为****p<0.001;与奥西替尼相比，显著性差异分别为*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001;采用Bonferroni的事后检验进行单因素方差分析。

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